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產(chǎn)品資料

DNA電泳常見(jiàn)問(wèn)題分析

上傳時(shí)間:2023/11/12 來(lái)源:易買(mǎi)儀器網(wǎng) 點(diǎn)擊:

脈沖場(chǎng)凝膠電泳

當雙鏈DNA分子超過(guò)一定的大小以后,DNA雙螺旋的半徑超過(guò)了凝膠的孔徑,在瓊脂糖中的電泳速度會(huì )達到極限,此時(shí)凝膠不能按照分子大小來(lái)篩分DNA,脈沖場(chǎng)電泳就解決了這一難題

脈沖電泳是在兩個(gè)不同方向的電場(chǎng),周期性交替進(jìn)行的,DNA分子在交替變換方向的電場(chǎng)中作出反應所需的時(shí)間顯著(zhù)地依賴(lài)于分子大小,DNA 越大,這種構象改變需要的時(shí)間越長(cháng),重新定向的時(shí)間也越長(cháng),于是在每個(gè)脈沖時(shí)間內可用于新方向泳動(dòng)的時(shí)間越少,因而在凝膠中移動(dòng)越慢。脈沖場(chǎng)凝膠電泳可以用來(lái)分離大小從10kb到10Mb的DNA分子

脈沖場(chǎng)凝膠電泳

1 儀器: WD-2101A脈沖電泳系統

2 配套試劑:脈沖電泳專(zhuān)用瓊脂糖(SeaKem Gold Agarose)、TBE

3 染料:GelRed等

在凝膠電泳中,溫度越高,DNA移動(dòng)的速度越快,但是條帶的清晰度和分辨率會(huì )明顯下降。溫度過(guò)高會(huì )導致DNA帶變形或解鏈,一般設置電泳溫度為14℃

常用緩沖液是0.5×TBE  H9812,2.2s-63.8s,19h

脈沖場(chǎng)電泳常見(jiàn)問(wèn)題及解決辦法

1)凝膠在緩沖液中漂浮–蠕動(dòng)泵的速度太快或太慢, 調到合適的速度

2)緩沖液不流動(dòng)或流速慢–檢查冷卻泵:當冷卻泵制 冷時(shí),如果蠕動(dòng)泵沒(méi)有開(kāi),會(huì )造成管道內結冰,導 致管道堵塞

3)電泳條帶扭曲–流速太低,導致制冷不充分,或不 均一、緩沖液的體積不能太小

4)條帶變粗–減少上樣量

5)條帶拖尾或模糊–電場(chǎng)轉換時(shí)間不合適,優(yōu)化轉換 電場(chǎng)轉換時(shí)間、上樣量太高,調整樣品濃度

6)大片段DNA不能有效分離–將低電壓、延長(cháng)電場(chǎng)轉換 時(shí)間

7)條帶彎曲–緩沖液緩沖能力下降,更換緩沖液、上 樣時(shí)樣品塊被擠碎、泵速度太慢

聚丙烯酰胺凝膠電泳

聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺(簡(jiǎn)稱(chēng)Acr)和交聯(lián)劑N,N-甲叉雙丙烯酰胺(簡(jiǎn)稱(chēng)Bis)在引發(fā)劑(eg.APS)和加速劑(eg.TEMED)的作用下聚合并聯(lián)成三維網(wǎng)狀結構的凝膠,以此凝膠為支持物的電泳稱(chēng)為聚丙烯酰胺凝膠電泳(簡(jiǎn)稱(chēng)PAGE)。

聚丙烯酰胺凝膠有下列優(yōu)點(diǎn):

1 在一定濃度時(shí),凝膠透明,有彈性,機械性能好。

2 化學(xué)性能穩定,與被分離物不發(fā)生化學(xué)反應。

3 對pH和溫度變化較穩定。

4 幾乎無(wú)電滲作用,只要Acr純度高,操作條件一致,則樣 品分離重復性好。

5 樣品不易擴散,且用量少。

6 凝膠孔徑可通過(guò)選擇單體及交聯(lián)劑的濃度調節。

7 分辨率高,尤其在不連續凝膠電泳中,集濃縮、分子篩和 電荷效應為一體,因而較醋酸 纖維薄膜電泳、瓊脂糖電 泳等有更高的分辨率。

聚丙烯酰胺凝膠聚合

聚合原理

1.聚丙烯酰胺是由丙烯酰胺(Acr)和甲叉雙丙烯酰胺(Bis)在催化劑作用下合成的。 催化系統常用有兩種: 過(guò)硫酸氨—TEMED化學(xué)催化聚合系統 此系統中,四甲基乙二胺(TEMED)稱(chēng)為加速劑,它能以自由基的形式存在。微量的TEMED的加入,可使過(guò)硫酸氨(APS,引發(fā)劑)形成自由基。這些自由基的產(chǎn)生可以引發(fā)丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺的交聯(lián)反應,形成具有一定孔徑的聚丙烯酰胺凝膠。

2. 核黃素—TEMED光聚合催化系統 此系統中,核黃素經(jīng)紫外線(xiàn)光解形成無(wú)色基,再被痕量氧氧化形成自由基,引發(fā)聚合反應。TEMED的存在,可以加速聚合,本催化系統主要用用于大孔濃縮膠的配置。

凝膠孔徑的可調性及性質(zhì)

1)聚丙烯酰胺凝膠的孔徑的大小是由單體和雙體在凝膠中的總濃度(T),以及雙體占總濃度的百分含量(C)即交聯(lián)度決定的。通常凝膠的篩孔、透明度和彈性是隨著(zhù)凝膠濃度的增加而降低的,而機械強度卻隨著(zhù)凝膠濃度的增加而增加。

2)凝膠濃度與孔徑的關(guān)系: T與C不僅與凝膠的機械性能有關(guān),還與凝膠的孔徑關(guān) 系極為密切。一般講,T濃度大,孔徑小,移動(dòng)顆粒 穿過(guò)網(wǎng)孔阻力大。此外,孔徑還同Acr與Bis的比例有 關(guān),Bis占Acr總濃度5%時(shí),孔徑最小。

3)凝膠濃度與被分離物相對分子量質(zhì)的關(guān)系:由于凝膠濃度不同,平均孔徑不同,能通過(guò)可移動(dòng)顆粒的相對分子質(zhì)量也不同。在操作時(shí),可根據被分離物相對分子質(zhì)量大小選擇所需凝膠的濃度范圍。也可先選用7.5%凝膠(標準膠),因為生物體內大多數蛋白質(zhì)在此范圍內電泳均可取得較滿(mǎn)意的結果。如分析未知樣品時(shí)也可用4%-10%的梯度膠測試,根據分離情況選擇適宜的濃度以取得理想的分離效果。


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