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技術(shù)資料

瓊脂糖凝膠電泳原理及應用

上傳時(shí)間:2023/11/12 來(lái)源:易買(mǎi)儀器網(wǎng) 點(diǎn)擊:

對于分子量大的樣品,如大分子核酸、病毒等,一般采用孔徑較大的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分離。

瓊脂糖是由半乳糖及其衍生物構成的中性物質(zhì),不帶電荷。瓊脂糖是直鏈多糖,它由D-半乳糖和3,6-脫水-L-半乳糖的殘基交替排列組成

瓊脂糖與瓊脂的區別

瓊脂是由瓊脂糖(agarose)和瓊脂果膠(agaropectin)組成的。瓊脂糖的結構單元是 D-半乳糖和3.6-脫水-L-半乳糖;瓊脂果膠是由許多更小的分子組成的異質(zhì)混合物。它們的結構相似,但瓊脂果膠帶硫酸根和羧基組分,凝膠能力差。 在瓊脂糖制備過(guò)程中需要把瓊脂果膠盡量去除,否則瓊脂糖有可能存在極微量硫酸根和丙酮酸取代電離基團,就會(huì )造成電內滲,電內滲對質(zhì)點(diǎn)的移動(dòng)產(chǎn)生影響。質(zhì)量較好的瓊脂糖硫酸根含量比較低,通常在0.2%以下,電內滲比較小,通常在0.13%以下。 簡(jiǎn)言之,瓊脂糖是從瓊脂中精細提取的,有自身獨特的性質(zhì),所以瓊脂糖要比瓊脂貴得多。

瓊脂糖凝膠電泳:實(shí)驗原理

1.DNA分子在堿性緩沖液中帶負電荷,在外加電場(chǎng)作用下向正極泳動(dòng)。

2.DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動(dòng)時(shí),有電荷效應與分子篩效應。不同DNA的分子量大小及構型不同,電泳時(shí)的泳動(dòng)率就不同,從而分出不同的區帶。

3.DNA 分子的遷移速度與相對分子質(zhì)量的對數值成反比關(guān)系。凝膠電泳不僅可分離不同相對分子質(zhì)量的DNA ,也可以分離相對分子質(zhì)量相同,但構型不同的DNA 分子。

瓊脂糖凝膠電泳

1. 根據電泳需要,配置合適濃度的電泳及制膠緩沖液。一般為 1× TAE或0.5×TBE。 注意:用于電泳的緩沖液和用于制膠的緩沖液必須是相同的。

2. 根據制膠量及凝膠濃度,在加有一定量的電泳緩沖液的三角錐瓶中,加入準確稱(chēng)量的瓊脂糖粉。 注意:總液體量不宜超過(guò)三角錐瓶的50%容量。

3. 在微波爐中加熱溶解瓊脂糖應注意:瓊脂糖充分完全溶解,否則,會(huì )造成電泳圖像模糊不清。加熱時(shí)如膠液劇烈沸騰發(fā)泡,停止加熱。微波爐中加熱時(shí)間不宜過(guò)長(cháng)。

4.使溶液冷卻至60℃左右,如需要可在此時(shí)加入溴化乙錠(EB)溶液使其終濃度為0.5ug/ml,并充分混勻——不提倡使用。 注意:溴化乙錠是一種致癌物質(zhì)。使用含有溴化乙錠的溶液時(shí),請戴用手套。溴化乙錠在可見(jiàn)光下會(huì )分解。

5.將瓊脂糖溶液倒入制膠模中,然后在適當位置處插上梳子。凝膠厚度一般在5-8 mm 之間。 注意:不要產(chǎn)生氣泡,溶液溫度太高(>60℃),會(huì )使得水分 過(guò)分蒸發(fā),改變凝膠離子濃度,影響電泳效果。

6.在室溫下使膠凝固(大約30 分鐘),然后放置于電泳槽中進(jìn)行電泳。 注意:凝膠不立即使用時(shí),用保鮮膜將凝膠包好在4℃下保存,或者放在制膠的緩沖液中,一般可保存2~5 天。

瓊脂糖凝膠電泳

1 儀 器:水平電泳儀、中低壓電泳儀電源、凝膠成像 分析系統 2 配套試劑:

(1)介 質(zhì):瓊脂糖凝膠

(2)緩沖液:TAE緩沖溶液(Tris堿、乙二胺四乙酸 二鈉二水、冰乙酸) TBE緩沖溶液( Tris堿、乙二胺四乙酸 二鈉二水、硼酸)

(3)上樣緩沖液: 6×DNA Loading Buffer(DNA樣 品專(zhuān)用包含:EDTA、甘油、二甲苯青 、溴酚藍)

(4)染 料: EB\ Gelred \ goldview \ GenGreen \ GenView \SYBRGreen等熒光染料

5 耗材: 滅菌的白槍頭、黃槍頭、藍槍頭、200ul\500ul\1.5ml離 心管等 6 DNA Marker 根據待測物分子量來(lái)定

瓊脂糖凝膠電泳緩沖液

有幾種緩沖液適用于天然雙鏈DNA的電泳 Tris-乙酸鹽和EDTA緩沖液(TAE) Tris-硼酸鹽緩沖液(TBE) Tris-磷酸鹽緩沖液(TPE)

瓊脂糖凝膠緩沖液

瓊脂糖凝膠緩沖液

三者之中,TAE的緩沖能力最低,雙鏈線(xiàn)狀DNA片段在TAE中比在TBE或TPE中遷移快10%,對于高分子量的DNA,TAE的分辨率略高于TBE或TPE,對于低分子質(zhì)量的DNA,TAE要差些。用于分析復雜基因組的Southern印跡均用TAE電泳緩沖液制備凝膠和電泳。超螺旋DNA在TAE中的電泳分辨率要好于TBE。

瓊脂糖凝膠緩沖液

TBE可以使用2-3次左右,而TAE用1-2次就要更換。電泳緩沖液多次使用后,離子強度降低,pH值上升,緩沖性能下降,可能使DNA條帶模糊或不規則DNA帶遷移。 電泳緩沖液剛好沒(méi)過(guò)凝膠1-2mm為好,太多則電流加大,凝膠發(fā)熱。

瓊脂糖凝膠上樣緩沖液

上樣緩沖液是上樣時(shí)與樣品一起加入泳道的。上樣緩沖液有三個(gè)作用:

1)增加樣品密度;

2)使樣品帶有顏色,便于上樣操作;

3)其中的指示劑在電場(chǎng)中以可以預測的泳動(dòng)速率 向陽(yáng)極遷移。 上樣緩沖液有幾種,但使用的指示劑基本都包括溴酚藍和二甲苯氰FF。

瓊脂糖凝膠上樣緩沖液

溴酚藍在瓊脂糖凝膠中遷移速率是二甲苯氰FF的2.2倍,這一特性與瓊脂糖凝膠的濃度無(wú)關(guān); 在0.5×TBE瓊脂糖凝膠電泳中溴酚藍的速率約與長(cháng)約300bp的線(xiàn)性雙鏈DNA相同,在0.5%-1.4%濃度的瓊脂糖凝膠中基本不會(huì )變化。 含有的甘油可以加大樣品的密度,使其大于TAE的濃度而沉降到點(diǎn)樣孔中,防止樣品飄出點(diǎn)樣孔


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